EVALUACIÓN DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE LA LECHE FRESCA EN LA ZONA TROPICAL DEL SUR DE VERACRUZ POR MÉTODOS DIRECTOS E INDIRECTOS

Palacios Gerónimo C1*, González González C.R.1, Retama Ortiz-Y.1, y Martínez Martínez O.1

1Instituto Tecnológico Superior de Acayucan

Carretera costera del golfo km 216.4 Col. Agrícola Michapan. Acayucan Ver.

Resumen:

Fecha de envío: 13, 07, 2018

La región sur de Veracruz se caracteriza por su alta producción de ganado y se producen más de
7,500,000 miles de litros de leche al año (INFOSIAP, 2016); de los cuales una gran fracción se destina principalmente a la fabricación del queso sin pasteurizar. Sin embargo, no existen estudios que describan la calidad microbiológica de la leche fresca y se estima que existe una alta prevalencia de enfermedades gastrointestinales derivadas del consumo de productos lácteos elaborados en la región. En este estudio hemos valorado la calidad de leche fresca de acuerdo a la norma PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012. Se analizaron 39 muestras de leche, de vacas recién ordeñadas y 21 muestras de leche mezclada recolectadas en seis ranchos de la colonia Tecuanapa, municipio de Acayucan, Veracruz. La determinación de mesófilos aerobios se realizó de acuerdo a la norma NOM-092-SSA1-1994 y los análisis de reducción de azul de metileno y resazurina de acuerdo la norma NMX-F-700-COFOCALEC-2004. Se evaluó la correlación de los resultados obtenidos a partir de los métodos indirectos (colorimétricos) y el método directo (recuento en placa). Los resultados indican que la leche fresca producida en esta localidad es de mala calidad, y que los métodos indirectos podrían sobrevalorar la leche. Estos índices sugieren que es imperativo tomar medidas tales como concientización, de prevención y monitoreo para disminuir la prevalencia de enfermedades asociadas al consumo de lácteos no pasteurizados en la región sur.

Palabras clave: leche fresca, calidad microbiológica, resazurina, azul de metileno, mesófilos aerobios

Abstract:

* Autor de correspondencia. E-mail: cruzpalge03@gmail.com

Tel. 9241112509

Manuscrito sometido 1

The southern region of Veracruz is characterized by its high cattle production; about 7,500,000 thousand liters of milk are produced annually (INFOSIAP, 2016), which are mainly intended for the manufacture of unpasteurized cheese. However, there are no studies that describe the microbiological quality of fresh milk and it is estimated that there is a high prevalence of gastrointestinal diseases derived from the consumption of dairy products manufactured in the region. In this study we have assessed the quality of fresh milk according to the norm PROY- NMX-F-700-COFOCALEC-2012. We analyzed 39 samples of milk of freshly milked cows and

21 samples of mixed milk, collected in six ranches of the colony of Tecuanapa, municipality of Acayucan, Veracruz. The determination of aerobic mesophylls was carried out in accordance with standard NOM-092-SSA1-1994 and the reduction analyzes of methylene blue and resazurin according to the standard NMX-F-700-COFOCALEC-2004. The correlation of the results obtained from the indirect methods (colorimetric) and the direct method (plate count) was evaluated. The results indicate that the fresh milk produced in this locality is of poor quality, and that indirect methods could overvalue the milk quality. This indicates that it is imperative to take measures such as awareness, and prevention, and monitoring to reduce the prevalence of diseases associated with the consumption of unpasteurized dairy products in the southern region.

Keywords: fresh milk, microbiological quality, resazurin, methylene blue, aerobic mesophylls

1. Introducción

La calidad sanitaria de la leche, utilizada como materia prima en la elaboración de productos lácteos, depende de factores como la calidad del agua, buenas prácticas de ordeño, sanitización de equipos y utensilios y la temperatura de enfriamiento. Auclair (1990). En el año 2008 COFEPRIS, reportó que dentro de los alimentos contaminados microbiológicamente los productos lácteos representan el 41% del total de alimentos analizados y los quesos frescos elaborados con leche sin pasteurizar están considerados como alimentos de mayor riesgo a la salud pública (COFEPRIS,
2008). Las pruebas colorimétricas de reducción de azul de metileno (TRAM) y la prueba de resazurina, son métodos rápidos que permiten valorar la calidad microbiológica de la leche cruda debido a la variación del potencial de oxido-reducción por el metabolismo microbiano. Sin
embargo, debido a las prácticas que se han adquirido en los últimos años entre los productores y

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los colectores de leche de añadir agentes bacteriostáticos para inhibir la acidificación de la leche, la respuesta de dichos métodos indirectos podría conducir a sobrevalorar la calidad microbiana de la leche. Pinzon (2006), menciona que los métodos indirectos como el TRAM están cada vez mas en deuso por su limitada capacidad para la determinación de numero de células viables. Sin embargo, la implementación del método directo en la recepción de centros de los acopio y queserías artesanales todavía es impráctica debido a las limitaciones económicas y de infractructura. El objetivo de este trabajo fue evaluar la calidad microbiológica de la leche del municipio de Acayucan, Veracruz, utilizando los métodos indirectos de reducción de azul de metileno (TRAM) y resazurina y el método directo de recuento de mesófilos aerobios en placa (BMA), para determinar la calidad de la leche de la zona de acuerdo a la especificación de la norma PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012.

Materiales y métodos

Las muestras de leche se recolectaron en seis ranchos de la comunidad de Tecuanapa, en el municipio de Acayucan, Veracruz. Se obtuvieron 39 muestras de leche de vacas individuales recién ordeñadas y 21 muestras de leche mezclada en bidones de cada rancho, la cual es utilizada en las queserías de la región. Las muestras se tomaron en frascos estériles, debidamente identificados y se transportaron en refrigeración hasta el laboratorio. Los reactivos utilizados en este estudio fueron: medio de cultivo para conteo en placa (PCA) (Sigma Aldrich®), solución de resazurina (Sigma Aldrich®) al 0.005% p/v, y solución de azul de metileno (Merck®) 0.005% p/v.
La determinación de mesófilos aerobios se realizó de acuerdo con la norma NOM-092-SSA1-1994 y los análisis de reducción de azul de metileno y resazurina de acuerdo con la norma NMX-F-
700-COFOCALEC-2012.El recuento de mesófilos aerobios totales se realizó en medio de cultivo PCA por extensión en placas en siembra por duplicado de las diluciones 10-3 y 10-4. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 h. Posteriormente se determinó las ufc·mL-1 por conteo en placa y los resultados se compararon con los establecidos en la norma NMX-F-700- COFOCALEC-2004.
Para la prueba de resazurina, se adicionó 1 mL de solución al 0.005% a 10 mL de muestra, contenida en tubos de ensayo estériles. Se homogenizaron los tubos y se incubaron a 37°C durante una hora. Los resultados de la calidad de la leche se interpretan de acuerdo con el cambio de

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coloración, y por comparación con la tabla patrón de coloración para la prueba de resazurina utilizada por Zemanate (2005), como se puede ver en la Tabla 1 y Fig. 1.
Tabla1. Cuadro de interpretación de prueba de resazurina

Coloración de la leche

Calidad de la leche

Azul (disco 6)

Violeta (disco 5) Malva (disco 4)

Buena

Rosa-Violeta(disco3) Malva-Rosa(disco2)

Rosa(dsco1)

Regular

Decoloración total

Mala

PROY-NMX-F-700 COFOCALEC 2012(DOF)


Fig. 1. Tabla patrón de coloración prueba de resazurina (Zemanate ,2005)
Para la prueba TRAM se adicionó 1 ml de azul de metileno 0.005% p/v a 10 mL de muestra, contenida en tubos de ensayo estériles. Se homogenizaron los tubos y se incubaron a 37 °C se registra con precisión la hora de incubación. Se observó el tiempo de decoloración de la muestra cada 30 min. Los tubos con la mezcla de leche decolorada se retiran y se registra el tiempo de decoloración. Los resultados de la calidad de la leche se interpretan de acuerdo con la Tabla 2,
según la norma PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012.

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Tabla 2. Cuadro de interpretación de resultados de la prueba de azul de metileno


(PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012)

Tiempo de decoloración

Número estimado de bacterias por mL

Calidad de la leche

5 h

100 000 a 200 000

Buena

2 a 4 h

200 000 a 2 millones

Buena a regular

Menos de 2 h

2 a 10 millones

Mala


Los análisis de correlación entre los diferentes métodos se realizaron a través del método de Spearman al tener al menos dos variables no paramétricas (métodos indirectos) comparando las escalas de TRAM y de resazurina contra las BMA contabilizadas por recuento de placas.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Una vez realizados los análisis de las muestras por los métodos indirectos de reducción de colorantes y por el método directo de recuento de BMA se obtuvieron los siguientes resultados de las 39 muestras individuales. Se puede observar en la Fig.2 que el 84.6% de las muestras tienen una calificación de calidad de buena a regular y 15.4% mala calidad en la prueba de TRAM.

Fig. 2. Resultados prueba reducción de azul de metileno (TRAM) en muestras individuales

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En la prueba de resazurina (Fig. 3) el 92.3% de las muestras tienen una calificación de calidad de leche regular y 7.7% mala calidad.

Fig. 3 resultados prueba de resazurina en muestras individuales
La Fig. 4 muestra el recuento de bacterias mesófilas aerobias en las muestras individuales donde el 84,5% presentó valores entre 1x 106 y 4 x106 ufc·mL-1 y 15.5% valores de más de 2 x 107 ufc·mL-1. Los valores se encuentran por arriba de los límites que marca la normatividad de 1.01 x
105 a 1.1 x 106 ufc·mL-1 para catergoria de leche buena a regular. Este resultado contrasta con los
obtenidos usando los métodos indirectos en donde mas del 70% de muestras caen en la categoría de regular.

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Fig. 4. Recuento de BMA en muestras de leche individual
Por otro lado, tanto la prueba de TRAM como la de resazurina realizadas a las 21 muestras de mezclas de leche de la ordeña, tienen como resultado calificación mala en el 100% de las muestras. Fig. 5 y 6.

Fig. 5. Resultados prueba de reducción de azul de metileno (TRAM) en muestras de mezcla de leche.

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Fig. 6 Resultados prueba de resazurina en muestra de leche compuesta.
En cuanto a la cuenta de bacterias mesófilas aerobias, las muestras presentaron resultados mayores a 2 x107 ufc.mL-1. Estos valores están por arriba de lo especificado por la norma NMX-F-700
COFOCALEC 2012 para una calificación de leche regular que marca valores de 3x105 a 1.1 x 106
cfu·mL-1. Lo anterior sugiere que hay un incremento considerable en la mezcla de las leches y que esto puede ser debido a una limpieza deficiente de los utensilios para la manipulación de la leche.
El estudio de la correlación entre los tres métodos de prueba se muestra en la Tabla 3, muestra que entre el recuento en placa de mesófilos aerobios y los valores de ufc·mL-1 estimadas por los métodos indirectos de TRAM y resazurina.

Tabla 1. Correlación de Spearman de resultados de la calidad microbiológica por el método directo (BMA ufc/mL),métodos indirectos: azul de metileno (TRAM) y de resazurina.


TRAM Resazurina

BMA (ufc/mL) 0.89 0.48

TRAM 0.53

Este resultado es similar al reportados por Espejo (1977), que indica una correlación alta en el recuento normal en placa de bacterias viables y la prueba indirecta de reduccion del azul de metileno con correlacion significativa (R2 =0.67) y mas recientemente con Silva et al. (2016) quien reporta una fuerza de correlación alta (R2 = 0.91) . Sin embargo, se observa que entre el recuento en placa de BMA y el tiempo de reducción en la prueba resazurina existe una correlación media,
debido posiblemente al 15% de los datos de ufc·mL-1 de BMA con valores de 2x 107 ufc·mL-1.

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Gonzales et al. (2010) reporta que la prueba de reducción de azul de metileno (TRAM) donde se establece que la correlacion de las variables tiempo necesario para la decoloracion y el numero de bacterias presentes en la leche es baja( -0.36 < 1 > 0.62) particularmente en leches mantenidas a bajas temperaturas.
En general se admite que la decoloracion es mas rápida cuanto mayor es el número de microorganismos en la leche, sin embargo algunas especies de microorganismos reducen el potencial de óxido reducción mucho mas rápidamente que otros. Asi el Streptococcus liquefaciens germenes del grupo coliaerogenos y los de putrefaccion (bacillus subtilis) se muestran muy activos. Mientras unos microorganismos pueden provenir del ambiente contaminado por el suelo y de residuos provenientes del tracto digestivo o con el contacto con agua contamina. Otra fuente de contaminación puede ser la ubre de la vaca. Por ello la prueba de reducción no se puede considerar como una prueba exacta para valorar el numero de bacterias realmente presentes (Pinzon, 2006).
Existen otros factores que pueden afectar el tiempo de reducción, ademas del tipo de microorganismos, el número de las celulas somáticas o leucocitos, el periodo de exposición a la luz y la cantidad de oxigeno disuelto. A medida que aumenta el número de leucocitos y la exposición a la luz el tiempo de reducción tiende a reducirse, mientras que la agitación (al aumentar el oxígeno disuelto) es un factor que tiende a retardar el tiempo de redución (Garcia, 2014). Otra de las causa es el uso de peróxido de hidrógeno, el cual retarda el periodo de reducción del reactivo dando como resultado un falso negativo.
Por otro lado, el grado de correlación entre el recuento de BMA y el tiempo de reducción de la prueba de TRAM es alta (R2 = 0.79). El azul de metileno ha sido catalogado como una tecnica precisa en cuanto a la calidad microbiológica, aunque tiene como limitante la incapacidad de distinguir entre tipos de bacterias (Lu et al. 2013). Su precisión puede aumentar con el acoplamiento de un sensor amperométrico; y su practicidad lo hacen un método factible para su uso en centros de acopio con grandes volúmenes de leche (Lu et al. 2013).
Los resultados obtenidos en las pruebas directas o indirectas coninciden en una calidad pobre de la leche. Es remarcable que la leche de mezcla fue significamente de menor calidad que las
muestras de ordeña individual. Esto indica que la mayor carga bacteriana contaminante puede

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provenir de los contenedores contaminados por una deficiente sanitización de los mismos. Pero tambien puede provenir de una mala práctica de ordeña, falta de refrigeración adecuada y de mastitis (Nirwal, Pant y Rai, 2013).
En otros estudios realizados en paises en desarrollo como Colombia, India e Iran, muestras obtenidas de granjas han resultado con leche contaminada por microorganismos. Por ejemplo, Vahedi et al. (2013) reportaron que de 100 muestras de leche cruda obtenidas en granjas, 42% resulto positivo para Escherichia (E.) coli, 36% para colifomes totales y 22% para Staphylococcus aureus. Nirwal et al. (2013) reportaron análisis de leche cruda provenientes de granjas por el método indirecto y 15% resultaron con calidad pobre (> 30 min), y 75% regular (1-1.5 hrs), solo un 2% se reporto como muy buena. Estos resultados coinciden con malas practicas de ordeña y manipulación de la leche comunes en el trópico. Los riesgos de salud que conlleva manufacturar productos lácteos con esta leche sin pasteurizar son elevados, considerando que esta es la razón por la que organismos como Listeria monocytogenes, E. coli productora de verocitotoxina (VTEC), Staphylococcus aureus, Salmonella y Campylobacter, estan asociados a enfermedades producidas por el consumo de estos productos (Verraes et al. 2015). En un estudio de la calidad de muestras de queso fresco producidos en Tabasco se ha reportado que el 67% de las muestras resultó positivo para coliformes fecales y el 63% para E. coli. Además de que el 17% era E. coli cepa diarreogénicas y 29% de las cepas aisladas fueron potencialmente consideradas como uropategénicas (UPEC) (Guzman-Hernandez et al. 2016). Lo anterior indica que es importante tomar acciones determinantes para disminuir la frecuencia de enfermedades transmitidas por el consumo de lácteos, tales como la concientización del personal acerca de las buenas prácticas de ordeña y así como la sanitización de todos los equipos y utensilios utilizados para la manipulación de la leche, así como un monitoreo mas vigilante por parte de las autoridades.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el recuento de BMA de ufc·mL-1, en el estudio de las muestras de leche de la colonia Tecuanapan del municipio de Acayucan, indican que el producto tiene una calificación de calidad mala, debido a la falta de buenas prácticas de higiene observadas en la ordeña y la recolección de la leche. Estos resultados coinciden parcialmente con los resultados obtenidos por los métodos indirectos: prueba de reducción de azul de metileno (TRAM) y prueba de resazurina. Los resultados de 84.6% y 92.3% de las muestras estudiadas con calificación de

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buena a regular a través de los métodos indirectos utilizados, indican que estos sobrevaloran la calidad de la leche, impidiendo que se tomen acciones correctivas o de rechazo. Por ello es necesario la implementación de programas de inspección y capacitación para mejorar las buenas prácticas en el proceso de obtención de la leche, que en su mayoría es utilizada para la producción de quesos frescos artesanales.
Finalmente, es importante evaluar el impacto socioeconómico real de las prácticas de producción de leche y manufactura de quesos actuales y las enfermedades transmitidas a través de estos, de manera que se sustente el fundamento para activar una acción definitiva por parte de las autoridades sanitarias para disminuir su efecto nocivo y ecónomico.

Nomenclatura

Eh

potencial de oxido reducción

mL

Mililitros

p/v

Unidad de concentración peso/volumen

ufc/mL

Unidades formadoras de colonias por mililitros

R2

Coeficiente de determinación

REFERENCIAS

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