INDUCCIÓN DE CULTIVOS in vitro DE Agave salmiana.

In vitro CULTURE INDUCTION OF Agave salmiana

C. Barrales-Fernández1, P. Monfil-Briones1 y F. Sandoval-Salas1*

1Instituto Tecnológico Superior de Perote. Carr. Federal Perote-México, Km 2.5, Col. Centro, C.P. 91270, Perote, Veracruz.

e-mail

: christell.barfer@gmail.com.

Resumen:

Las plantas de A. salmiana, tienen un periodo de crecimiento lento, y su mecanismo de propagación puede ser sexual o asexual, entre los 10 y 15 años de vida. Se han reportado trabajos de micropropagación de plantas crasuláceas, como A. atrovirens y A. macroacantha. En estos estudios se evaluaron diversos métodos de cultivo in vitro y adición de fitohormonas para la propagación vegetal. Es por ello objetivo del presente estudio es evaluar un método in vitro para propagación vegetal de Agave salmiana, mediante el uso auxinas y citoquininas como reguladores del crecimiento. Dónde las semillas tuvieron una tasa de supervivencia del 72 %. La combinación de los reguladores del crecimiento 2,4-D (2.0 g/L) y K (2.0 g/L) indujeron la formación de callos. Se observó formación de tejido embrionario en los tratamientos con únicamente 2,4-D (0.1 g/L y 1.0 g/L).

Palabras clave: Agave salmiana, micropropagación, fitohormonas.

Abstract:

The plants of A. salmiana, have a period of slow growth, and their mechanism of propagation can be sexual or asexual, between 10 and 15 years of life. Micropropagation work has been reported on crassulaceous plants, such as A. atrovirens and A. macroacantha. In these studies, various methods of in vitro culture and addition of phytohormones for plant propagation were evaluated. Therefore, the objective of this study is to evaluate an in vitro method for plant propagation of Agave salmiana, by using auxins and cytokinins as growth regulators. Where the seeds had a survival rate of 72%. The combination of growth regulators 2,4-D (2.0 g / L) and K (2.0 g / L) induced callus formation. Embryonic tissue formation was observed in treatments with only 2,4-D (0.1 g

/ L and 1.0 g / L).

Keywords: Agave salmiana, micropropagation, phytohormones.


* Autor de correspondencia. E-mail: investiga.itspe@gmail.com

Tel. 01-(282)-825-3150

1. Introducción

En México existen diversas especies de Agave, entre las que destacan las especies de Agave americana, Agave atrovirens, Agave mapisaga y Agave salmiana (Nobel et al., 2002; Escobar-Guzman et al., 2008; Puente-Garza et al., 2017). El Agave salmiana, pertenece a la familia de la Agavácea, son plantas que alcanzan hasta 2 m de altura, viven entre 10 y 15 años, las plantas están compuestas principalmente por el cogollo, penca (hojas), tallo, rizoma y sistema radicular; el color puede variar de acuerdo a la variedad. La parte aérea de la planta está integrada por hojas y tallo, las hojas son largas y fibrosas de forma lanceolada, con arreglo en forma de roseta, con espinas laterales y espina apical (Cervantes-Pérez et al.,
2018). La reproducción es de tipo sexual, por semillas, o asexual, mediante esquejes, rebrotes
o hijuelos (Escobar-Guzman et al., 2008; Ramírez‐Tobías et al., 2012; Puente-Garza et al.,
2017). Son plantas de climas templados a semicálidos extremos, con temperaturas anuales
de entre los 16°C a los 22°C, se desarrollan en suelos rocosos, yesíferos y con material ígneo
(Puente-Garza et al., 2017).
La explotación del Agave salmiana en México incluye la producción de aguamiel, pulque y la cutícula de las hojas para elaborar “mixiotes” (Puente-Garza et al., 2017; Cervantes-Pérez et al., 2018), también tiene usos en la construcción de cercas y recubrimiento de techos; en la agricultura se le suele utilizar para la definición de linderos y como cercas vivas para evitar la erosión del suelo; mientras que las hojas son utilizadas como fertilizantes (Nobel et al.,
2002; Escobar-Guzman et al., 2008).
El Cultivo in vitro se utiliza comúnmente para introducir, multiplicar y regenerar material vegetal o animal de manera masiva, bajo condiciones de luz artificial controlada y en medios de cultivo enriquecidos con sales minerales, vitaminas y reguladores de crecimiento (Puente- Garza et al., 2017; Salazar-Mercado y Vega-Contreras, 2017). Este tipo de técnicas permite producir una gran cantidad de plántulas en un periodo de tiempo relativamente corto, dependiendo de la especie; siendo de gran importancia para la producción de aquellas especies en donde se presentan casos de baja germinación, crecimiento lento o retardo en la floración (Delgado y Hoyos, 2016). La micropropagación o propagación clonal, que es una de las aplicaciones del cultivo in vitro, consiste en la obtención de plantas seleccionas con características de desempeño agronómico, libres de virus y con tiempos de desarrollo cortos, las cuales se desarrollan a partir de un fragmento de la planta madre (Toribio, 2005; Puente-
Garza et al., 2017). También, se ha reportado que en uso de hormonas fomentan la producción y enraizamiento de mini-esquejes, favoreciendo la propagación vegetativa (Delgado y Hoyos, 2016). En las técnicas de micropropagación se emplean reguladores del crecimiento, los cuales pueden ser de origen natural o sintéticos, y que tienen influencia sobre un proceso fisiológico específico (Toribio, 2005). Los reguladores mayormente utilizados son las auxinas y las citoquininas, las primeras interfieren en los procesos vegetales, como el crecimiento diferencial y la regulación de los fenómenos de diferenciación; mientras que las citoquininas estimulan la citocinesis, actúan promoviendo la división celular, el crecimiento de las raíces, el alargamiento de las hojas, entre otras (Toribio, 2005).
Tomando en cuenta que en el país hay una sobreexplotación de Agave salmiana, y que el tiempo natural de crecimiento es de varios años, haciendo uso de la biotecnología de micropropagación es que el objetivo principal del presente estudio es evaluar un método in vitro para la propagación vegetal de Agave salmiana mediante el uso auxinas y citoquininas como reguladores del crecimiento.

2. Materiales y métodos

2.1 Material biológico

Las semillas se colectaron en la comunidad de Rancho Nuevo, perteneciente al municipio de Perote, Veracruz, México a partir de plantas de Agave salmiana con porte de aproximadamente 4 m en estado de floración. Se evalúo la viabilidad de germinación de las semillas, colocándolas en un recipiente con agua purificada, donde las semillas que se mantienen en la superficie son desechadas. Las semillas fueron lavadas con agua estéril y una solución de hipoclorito de sodio (50% v/v).

2.2 Inducción de la germinación “in vitro

Se utilizó un medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962), que contiene macro y micro nutrientes necesarios para el desarrollo de las plántulas, se adicionó sacarosa 20 g/L, se ajustó a un pH de 6 y se mantuvo en agitación hasta homogenizar la mezcla; se agregó agar bacteriológico y se calentó hasta temperatura de ebullición. Se hizo un vaciado en contenedores de vidrio de capacidad de 100 mL y se esterilizaron a 121°C, 15 lb, 17 min, con tapa de aluminio, y dejaron solidificar. Las semillas viables lavadas y desinfectadas se colocaron en los contenedores con el medio de cultivo y fueron incubados a

25±2°C. El porcentaje de germinación, contaminantes, inducción del callo, diferenciación

(desarrollo del brote) y enraizamiento de las plántulas se observó cada 5 días.

2.3 Evaluación de los reguladores del crecimiento en la inducción de los callos

Los explantes resultantes se transfirieron a contenedores de vidrio con capacidad de 100 mL, con medio MS suplementado con la combinación de la auxina 2,4-diclorofenoxiacético (marca Sigma-Aldrich), y las citoquininas, cinetina (marca Sigma-Aldrich) o Bencilaminopurina (marca Sigma-Aldrich). Se incubaron a 25±2°C, y se evaluó el efecto de cada regulador, mediante la observación de crecimiento, formación de callos y contaminación bacteriana o fúngica, cada 5 días. Para la determinación de las concentraciones, se realizó un arreglo factorial con las concentraciones (0.0, 0.1, 1.0 y 2.0 g/L) de cada regulador (Cuadro 1). Los tratamientos se realizaron por triplicado.

Cuadro 1. Diseño factorial de los reguladores del crecimiento.

3. Resultados y discusión

3.1 Evaluación de la germinación de semillas de A. salmiana

Se colectaron un total de 287 semillas, de las cuales resultaron viables 190 semillas. Las plantas germinaron entre los días 1 y 5 después de la siembra, teniendo un porcentaje de supervivencia del 72 %, se consideraron explantes viables aquellos que se observaron libres de contaminación bacteriana o fúngica y que estuvieran en crecimiento activo. Se obtuvo un porcentaje de asepsia en los cultivos del 66-85%. Según lo que mencionan Arizaga y Ezcurra
(2002), quienes estudiaron los mecanismos de propagación en Agave macroacantha, el 14 % de las semillas son viables para germinar, de las cuales cerca del 85 % germinaron en un periodo máximo de 8 días, siendo comparable con los datos obtenidos en el presente estudio.
En un estudio realizado por Ramírez‐Tobías et al. (2012), donde evalúa parámetros de
correlación que influyen en la germinación de las semillas, encontró que la temperatura
óptima para la germinación de semillas de A. salmiana es a 20°C, por lo que la temperatura establecida para la germinación en el presente estudio fue la idónea para fomentar la germinación de las semillas.

3.2 Inducción de cultivos desdiferenciados

Los hipocotilos obtenidos fueron usados para la micropropagación masiva de maguey, con los diferentes tipos y concentraciones de reguladores de crecimiento vegetal. Se observaron callos friables completamente desdiferenciados y los callos semidiferenciados (Fig. 1), con similitud al tejido embriogénico, en estos últimos se observó la formación de estructuras de
propagación similares a las obtenidas en semillas sexuales.

A B

Figura 1. Crecimiento desdiferenciado de A. salmiana; (A) callo "friable" y (B) callo tipo "embriogénico".

La secuencia de del cultivo de los callos de A. salmiana se observa en la Fig. 2, donde se observa desde la recuperación de las semillas viables, siembra sin reguladores del crecimiento y posterior crecimiento con la adición de los reguladores del crecimiento vegetal.

Figura 2. Desarrollo de los cultivos diferenciados de A. salmiana; (A) semillas; (B)

hipocotilos; (C) explantes; (D), (E) y (F) callos.

El color de los callos fue blanquecino a amarillo claro, siendo similares a los reportados por Cervantes-Pérez et al. (2018) y Toribio (2005), quienes trabajaron con explantes de Agave salmiana y Agave atrovirens, respectivamente.

3.3. Evaluación de la respuesta de los reguladores de crecimiento vegetal

De acuerdo a las concentraciones del Cuadro 1. El efecto de los reguladores del crecimiento sobre los callos fue mayor a concentraciones altas de cinetina (2 g/L) en combinación con
2,4-D (2 g/L), observando el mismo comportamiento con todas las concentraciones de 2,4 - D en combinación con K, también se observó que tuvo un efecto positivo a concentraciones bajas de K, no siendo así para las concentraciones intermedias de este regulador, donde los tejidos no mostraron alteraciones, además que otros necrosaron (Fig. 4). Por otra parte, en los tratamientos donde no se utilizó K, se formaron estructuras de embriones, para las concentraciones de 2,4-D de 0.1 g/L y 1.0 g/L. En cuanto a los tratamientos con BAP, no se indujeron callos.

Figura 3. Tratamiento de los tejidos de A. salmiana con diferentes concentraciones de

auxinas y citoquininas.

Toribio (2005), realizó un trabajo sobre explantes de Agave atrovirens, adicionando 2,4-D y BAP para la inducción de los callos, y obtuvo que en concentraciones de 0.5, 1.0 y 1.5 mg/L de BAP los tejidos necrosaron, además de que no hubo respuesta de callogénesis. En tratamientos con auxina-citocina a concentraciones de 1.0-1.5 mg/L, se formaron callos en un 75 % y 80 % de los callos de color blanco opaco, semicristalino, compacto con capacidad de proliferación, con tejidos desdiferenciados. Estos resultados son similares a los estudiados en el presente estudio.
Sandoval et al. (2010), realizaron un estudio sobre la producción de tejidos de Indigofera suffuticosa Mill., adicionando una combinación de fitohormonas 2,4-Diclorofenoxiacético,
6-Benciladenina y cinetina, dónde encontraron que la combinación de 2,4- Diclorofenoxiacético y 6-Benciladenina, promueve la diferenciación y el crecimiento de los callos, obteniendo mejores características morfológicas y de crecimiento. Siendo comparable con los resultados en el presente estudio, puesto que la adición de la combinación de las
fitohormonas 2,4-D y K, fomentaron la inducción de los callos de A. salmiana. Otro estudio realizado por Coutiño-Cortés et al. (2017), estudiaron el efecto de la adición de auxinas y citoquininas sobre la inducción de callos de Guarianthe skinneri, encontrando que las citoquininas tuvieron una mejor respuesta sobre la producción de callos, siendo resultados comparables con lo reportado en el presente estudio. Al igual que los resultados obtenidos por Restrepo et al. (2018).

4. Conclusiones

La tasa de supervivencia de las semillas fue del 72 %, los explantes bajo la influencia de la combinación de los reguladores del crecimiento 2,4-D y cinetina en las concentraciones de
2.0 g/L y 2.0 g/L promovieron la formación de callos. En los tratamientos con 2,4-D (0.1 g/L y 1.0 g/L) se formaron embriones. Por lo que es factible el empleo de reguladores del crecimiento en la micropropagación de A. salmiana.

Agradecimientos

Productores de la comunidad de Rancho Nuevo, perteneciente al municipio de Perote, Veracruz, México por el apoyo para las plantas de A. salmiana, y las atenciones necesarias.

Nomenclatura

°C

Grados centígrados

2,4-D

2,4-diclorofenoxiacético

BAP

Bencilaminopurina

g

Gramos

K

Cinetina

L

Litros

lb

Libras

m

Metros

min

Minutos

mL

Mililitros

MS

Medio de cultivo Murashige y Skoog

v/v

Relación volumen/volumen

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