CONTROL DE LISTERIA INNOCUA EN QUESOS POR PEDIOCOCCUS ACIDILACTICI ITV26 PRODUCTORA DE BACTERIOCINA

Micloth López del Castillo Lozano 1, Ricardo Hernández Lozano 2, Lilia Ortiz Rodríguez 3*, Cynthia Cristina Arcila Lozano 4, Carmen Bulbarela Sampieri 5.
*Autor por Correspondencia: mc.ortizlilia@gmail.com (228)8358707

Área temática de la Investigación: Bioquímica e Ingeniería en Alimentos

Micloth López del Castillo Lozano, Investigador, Universidad Veracruzana; Ricardo Hernández Lozano, Ingeniero graduado en IIA, Instituto Tecnológico Superior de Perote; Lilia Ortiz Rodríguez, Profesora, Instituto Tecnológico Superior de Perote; Cynthia Cristina Arcila Lozano, Profesora, Instituto Tecnológico Superior de Perote; Carmen Bulbarela Sampieri, Profesora, Universidad Veracruzana.

Resumen:

El objetivo de este trabajo fue demostrar la actividad antimicrobiana de Pediococcus acidilactici ITV26 en contra de Listeria innocua AST-062, como bacteria contaminante en un modelo de queso almacenado en refrigeración a 12 °C. Diferentes lotes de quesos fueron inoculados al mismo tiempo con dos concentraciones de P. acidilactici ITV26 (103 y 107 UFC/g) y con tres concentraciones de L. innocua AST-062 (103, 105, y 107 UFC/g). Los resultados mostraron que Pediococcus fue capaz de inactivar parcialmente a Listeria en el modelo de queso utilizado, manifestando una actividad principalmente del tipo bacteriostático. Debido a que el crecimiento de L. innocua es aún favorable en los quesos bajo condiciones de refrigeración, se propone evitar la contaminación de la leche y de sus productos derivados por esta bacteria patógena.

PALABRAS CLAVE: Queso, Listeria, Pediococcus, bacteriocina, seguridad alimentaria.

Abstract:

The aim of this study was to demonstrate the antimicrobial activity of Pediococcus acidilactici ITV26 against Listeria innocua AST-062, as contaminant bacterium in a cheese model stored in refrigeration to 12 °C. Different batches of cheeses were inoculated at the same time with two different concentrations of P. acidilactici ITV26 (103 and 107 UFC/g) and three concentrations of L. innocua AST-062 (103, 105, and 107 UFC/g). The results showed that Pediococcus was able to partially inactivate Listeria in the cheese model used, showing a mainly bacteriostatic activity. Due to the remaining growth of L. innocua in the model cheeses storaged under refrigeration conditions, it is suggested to avoid the contamination of milk and its byproducts by this pathogen bacterium.

KEYWORDS: Cheese, Listeria, Pediococcus, bacteriocin, food safety.

1. Introducción

Las bacterias ácido lácticas son un grupo heterogéneo de bacterias reconocidas por la FDA como seguras para su uso y consumo en alimentos. Entre otras cosas, las bacterias lácticas se utilizan ampliamente en la industria de los alimentos por las características de sabor, aroma y textura que pueden impartir al medio o alimento donde son cultivadas. Asimismo, la producción de ácido láctico y otros compuestos con características antimicrobianas, como son las bacteriocinas, ha también permitido su empleo con fines de control de bacterias contaminantes, algunas de ellas potencialmente patógenas (1). Las bacteriocinas son compuestos peptídicos o pequeñas proteínas producidas por un gran número de bacterias lácteas, las cuales se ha demostrado que son capaces de controlar e inhibir el desarrollo de otras bacterias competitivas presentes en el mismo medio donde se desarrolla la cepa productora. En general, las bacteriocinas solo son activas contra especies relacionadas con la cepa productora, aunque hay algunas que tienen también un mayor espectro de inhibición (2). La nisina, la plantaricina y las pediocinas son algunos ejemplos de bacteriocinas producidas por bacterias lácticas (3,4). Esta última, la pediocina, es una bacteriocina producida por algunas cepas de bacterias del género Pediococcus, que son bacterias lácticas encontradas y utilizadas frecuentemente en alimentos fermentados de origen animal y vegetal. Las pediocinas han demostrado ser activas contra un espectro amplio de bacterias potencialmente patógenas, entre las más estudiadas se incluyen Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes, las cuales pueden encontrarse en productos cárnicos y lácteos (3). En el caso de Listeria, se ha demostrado su presencia como bacteria oportunista y emergente. El género Listeria comprende seis especies, entre ellas L. monocytogenes y L. innocua (5). Se ha reportado su presencia en diversos medios además del hospitalario y clínico, incluyendo instalaciones de rastros, y algunos alimentos cárnicos y lácteos preparados con leche no pasteurizada (6). Una vez consumida con los alimentos, listeria puede provocar la enfermedad denominada listeriosis, la cual ha sido vinculada con casos de aborto en animales y humanos y en casos extremos a la muerte de los sujetos infectados. Es por ello que en el presente trabajo se planteó determinar la capacidad de la cepa de pediococco P. acidilactici ITV26 para controlar el crecimiento de listeria (L. innocua AST-062) bajo condiciones de refrigeración en quesos elaborados como un sistema modelo.

2. Materiales y métodos

Conservación y cultivo de las cepas de microorganismos

Pediococcus acidilactici ITV26 y Listeria innocua AST-062 fueron amablemente proporcionadas por la Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos del Instituto Tecnológico de Veracruz, y conservados en forma liofilizada hasta su uso. Para su activación P. acidilactici fue resuspendido en

medio MRS, mientras que L. innocua fue resuspendida en medio LB, y ambas fueron incubadas a
25°C hasta observar crecimiento (24 a 36 h). Una vez activadas se prepararon cultivos de trabajo resembrando en los medios apropiados bajo las mismas condiciones de activación hasta alcanzar su fase estacionaria y una concentración de 1x109 UFC mL-1.

Elaboración de los quesos modelo

Para la elaboración de los quesos modelo se utilizó leche de vaca obtenida de una producción cercana al laboratorio, a la cual se le realizó un análisis fisicoquímico, se estandarizó el contenido de grasa y proteína, y se pasteurizó a 65°C por 30 min, para reproducir el método artesanal seguido por la quesería de donde se obtuvo la leche. Se utilizaron lotes de tres litros de leche pasteurizada para la producción de cada lote de queso. Para la elaboración de los quesos se adicionó 0.20 g/L de cloruro de calcio y 1.5 ml/L de una solución madre de 0.15 mL/L de cuajo comercial en agua. Se mezcló completamente y se dejó en reposo hasta alcanzar el punto máximo de cuajada (aproximadamente en
40 min). Posteriormente se realizaron cortes de aproximadamente 1 cm2, se retiró el suero, y se
adicionaron 16 g/L de sal mezclando suavemente durante 10 min, y se procedió al moldeado bajo presión para obtener quesos modelo de 20 g cada uno.

Preparación de los quesos para las pruebas de actividad contra listeria

Los quesos elaborados se dividieron en tres grupos, según el tratamiento a recibir. El primer grupo fue de quesos control negativo, sin ninguna bacteria inoculada. El segundo grupo fue de quesos control positivo de crecimiento, inoculados independientemente con cada una de las bacterias (pediococco o listeria). El tercer grupo fue el correspondiente a los quesos de tratamiento. Tanto los quesos control positivo y los de tratamiento con pediococco fueron inoculados al inicio de su elaboración para obtener una concentración de 103 y 107 UFC/L de P. acidilactici ITV26. Los quesos control positivo y de tratamiento con listeria se sumergieron en suspensiones conteniendo 103, 105 y 107 UFC/L de L. innocua AST-062, y se mantuvieron en agitación suave durante una hora. Finalmente, todos los quesos fueron colocados sobre una malla en recipientes de plástico y almacenados bajo refrigeración a 4 y 12
°C hasta su análisis.

Determinación de la actividad de P. acidilactici ITV26 contra L. innocua AST-062.

Para determinar la inhibición del crecimiento de la listeria por el pediococus se analizaron los quesos cada tres días durante 12 días (los almacenados a 4 °C) y 14 días (los almacenados a 12 °C). Para ello, cada queso se trituró y homogenizó en 180 ml de agua durante 30 s utilizando una batidora comercial.
La muestra obtenida se sembró utilizando el método estándar de dilución decimal e inclusión en agar MRS o LB. Para poder diferenciar el crecimiento de ambas bacterias, se adicionó una mezcla de 10 g de sulfametoxazol y 2 g de trimetoprima al medio MRS a una dilución final de 1:1000, de acuerdo con lo reportado por otros autores (7). Las cajas así preparadas se incubaron a 25 °C por 24 h, y se registró el número de unidades formadoras de colonias obtenidas.

3. Resultados y discusiones

En este estudio se determinó la inhibición de L. innocua AST-062 por P. acidilactici ITV26 en quesos
modelo conservados en refrigeración a 4 y 12 °C. A estas temperaturas de almacenamiento, en los quesos control positivo de crecimiento, se observaron crecimientos normales para ambas bacterias, por lo que a continuación se presentan solo los resultados de los quesos sometidos a tratamiento de inhibición de la listeria por el pediococco.
Así, L. innocua AST-062 fue inhibida por la presencia de Pediococcus a las tres concentraciones iniciales de prueba de listeria, y en ambas temperaturas de almacenamiento. En la figura 1 se presentan las cinéticas de inhibición a la temperatura de 12 ° C. La inhibición máxima observada fue de al menos dos ciclos logarítmicos con respecto al control sin Pediococcus. De acuerdo con nuestros resultados, la concentración inicial de Pediococcus más efectiva para el control de la listeria es de 103 UFC/g. Esto pudiera estar ligado al propio crecimiento de Pedicococcus, el cual al iniciar en una concentración más baja es capaz de producir mayor cantidad de bacteriocina. Pérez Espitia et al. (9) reportan que la pediocina de P. acidilactici ITV26 por si sola y en combinación con EDTA, nisina y ácido láctico, es capaz de inhibir totalmente a L. innocua AST-062 en un medio líquido agitado (140 rpm) a 37 ºC en un tiempo de 12 -18 h. El efecto de barrera de las proteínas y de la grasa, componentes mayoritarios del queso, podría estar retardando este efecto máximo en nuestro estudio, como lo sugirieron Perin et al. (4).

Figura 1 Inhibición del crecimiento de L. innocua AST-062 a diferentes concentraciones de P. acidilactici ITV26 en quesos almacenados en refrigeración a 12 °C. Inóculo inicial (UFC/g) de L. innocua: A) 103, B) 105, C) 107.

4. Conclusiones

En este trabajo se investigó la capacidad de inhibición de una cepa de Pediococcus en contra de listeria
bajo condiciones de refrigeración en un queso modelo. Los resultados muestran que Pediococcus fue capaz de inhibir el crecimiento de Listeria en al menos dos ciclos logarítmicos. Es posible que los constituyentes del queso estén funcionando como barrera para no alcanzar una mayor inhibición. Pediococcus acidilactici ITV26 fue capaz de inhibir el crecimiento de Listeria innocua AST-062 en queso por al menos doce días de almacenamiento en condiciones de refrigeración. Estos resultados permiten considerar que el pediococco podría ser aplicado directamente en un alimento lácteo y ejercer su actividad antimicrobiana.
Se recomienda continuar con el estudio de producción y distribución de la bacteriocina en la matriz del queso bajo las condiciones de este estudio y a temperatura ambiente, incluyendo su posible interacción con las fases lipídicas y proteicas del modelo quesero.

Agradecimientos

Nuestro agradecimiento a la Maestra Cristina Landa Morales, docente del Instituto Tecnológico Superior de Perote, por la traducción del texto al idioma inglés, graduada de Master in English Language Teaching, University of Southampton.
Nuestro agradecimiento a la Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos del Instituto
Tecnológico de Veracruz por donar las cepas para este estudio.

Nomenclatura

UFC/g

Unidades formadoras de colonias g-1

rpm

Revoluciones por minuto

UFC/L

Unidades formadoras de colonia L 1

FDA

Food and Drug Administration

L

Listeria

P

Pedicococcus

REFERENCIAS

1. Cleveland, J., Montville, T.J., Nes, I.F., Chikindas, M.L. 2001. Bacteriocins: safe, natural
antimicrobials for food preservation. International Journal of food Microbiology, 71(1), 1-20.
2. Todorov, S.D. 2008. Bacteriocin production by Lactobacillus plantarum AMA-K isolated from Amasi, a Zimbabwean fermented milk product and study of the adsorption of bacteriocin AMA-K to Listeria sp. Brazilian Journal of Microbiology, 39(1), 178-187.
3. Fernández, K.J., Chanci, I.C., Wilches, L., Cardona, J.A. 2014. Caracterización de los metabolitos de bacterias ácido lácticas y efecto inhibidor de las bacteriocinas en microorganismos patógenos en alimentos: revisión sistemática de la literatura, 2008-2012. Revista Biosalud, 13(1), 45-61.
4. Perin, L.M., Miranda, R.O., Camargo, A.C., Colombo, M., Carvalho, A.F., Nero, L.A. 2013. Antimicrobial activity of the Nisin Z producer Lactococcus lactis subsp. lactis Lc08 against Listeria monocytogenes in skim milk. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 65(5), 1554-
1560.
5. Vera, A., González, G., Domínguez, M., Bello, H. 2013. Principales factores de virulencia de
Listeria monocytogenes y su regulación. Revista Chilena de Infectología, 30(4), 407-416.
6. Martino Zagovalov, T.K., Leyva Castillo, V., Pérez Chang, A., de los Reyes, M., Suárez Herrera, F., Lara Ortiz, C. 2005. Determinación de Listeria spp. en quesos y embutidos comercializados en Cuba. Revista Cubana de Salud Pública, 31(3), 217-222.
7. Villalobos de Bastardo, L.B., Martínez Nazaret, R.E. 2006. Susceptibilidad antimicrobiana de Listeria spp. aislada de alimentos durante el periodo 2003-2004. Cumaná, Venezuela. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 26(1), 31-34.
8. López, L.I., Escudero, B.I., Mendoza García, P.G. 2001. Efecto de la combinación de bacteriocinas, ácido láctico y EDTA sobre patógenos de alimentos. IX Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería. 10-14 de septiembre, 2001. Recuperado de: www.bit.ly/smbb01-bacteriocina.
9. Pérez Espitia, P.J., Reina Pacheco, J.J., Ramos de Melo, F., Ferreira Soares, N.N., Durango, A.M.
2013. Packaging properties and control of Listeria monocytogenes in bologna by cellulosic films incorporated with pediocin. Brazilian Journal of Food Technology, 16(3), 226-325.
10. Wu, C.W., Yin, L.J., Jiang, S.T. 2004. Purification and characterization of bacteriocin from
Pediococcus pentosaceus ACCEL. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(5), 1146–1151.